课题3酵母细胞的固定化（教辅）

shengwujiaoxue

课题3酵母细胞的固定化

知识一　固定化酶和固定化细胞技术

1．概念
利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
2．方法
(1)包埋法：多适于细胞的固定化；
(2)多适于酶的固定化。
3．载体
包埋法固定化细胞常用的是不溶于水的多孔性载体材料，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
4．优点
(1)固定化酶既能与反应物接触，又能与产物分离，可以反复利用。
(2)固定化细胞技术制备的成本低，操作容易。
5．实例——高果糖浆的生产
(1)原理：葡萄糖果糖。
(2)生产过程：
①将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入。
②使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触。
③转化成的果糖，从反应柱的下端流出。
(3)反应柱：酶固定在一种颗粒状的载体上，再将其装入反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由通过。
(4)优点：反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。

思考探究
1．酶能加快化学反应速率，但溶液中的酶难以回收，不能利用。要想既降低生产成本，又不影响产品质量，该如何解决这一问题？
提示：将酶固定于不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与反应物分离，还可重复利用。
2．固定化酶和固定化细胞一般采用什么方法？为什么？
提示：固定化酶常用化学结合法或物理吸附法。因酶分子小，易从包埋材料中漏出，故一般不用包埋法进行固定。固定化细胞常用包埋法，因个大的细胞难以被吸附或结合。
3．从操作角度来考虑，你认为固定化酶技术与固定化细胞技术哪一种方法更容易？哪一种方法对酶活性的影响更小？
提示：固定化细胞技术。固定化细胞技术。
4．固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种方法？
提示：一系列酶；固定化细胞技术。
5．如果反应物是大分子物质，又应该采用哪种方法？为什么？
提示：固定化酶技术。因为大分子物质不容易进入细胞内，如果采用固定化细胞技术会使反应效率下降。

直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较
项目        直接使用酶        固定化酶        固定化细胞
酶的种类        一种或几种        一种        一系列酶
常用载体        无        高岭土、皂土、硅胶、凝胶        明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺
制作方法        无        化学结合固定化、物理吸附固定化        包埋法固定化
是否需要营养物质        否        否        是
催化反应        单一或多种        单一        一系列
反应底物        各种物质(大分子、小分子)        各种物质(大分子、小分子)        小分子物质
优点        催化效率高，低耗能、低污染等        被固定的酶可重复使用        成本低，操作更容易
缺点        ①对环境条件非常敏感，易失活；②难回收，成本高，影响产品质量        不利于催化一系列的酶促反应        反应物不易与酶接近，尤其是大分子物质，反应效率下降

[特别提醒]
(1)固定化细胞使用的都是活细胞，在反应时需要适宜的生存条件。
(2)由于被固定的细胞保证了完整性，酶的环境改变较小，所以对酶活性影响不大。

知识点二　酵母细胞固定化的实验操作

1．制备固定化酵母细胞

2．用固定化酵母细胞发酵
(1)操作步骤：将用蒸馏水冲洗过的固定好的酵母细胞(凝胶珠)用于发酵的葡萄糖溶液中。
(2)现象

思考探究
1．在配制海藻酸钠溶液时，用小火加热并不断搅拌的目的是什么？
提示：防止海藻酸钠焦糊。
2．为什么海藻酸钠溶液要冷却后才能加入酵母细胞？
提示：防止温度过高杀死酵母菌。
3．将凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30 min的作用是什么？
提示：使胶体聚沉，以便形成稳定的结构。

1．制备固定化酵母细胞的注意事项
(1)在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。酵母细胞需要的活化时间较短，一般为0.5～1 h，但实验时需要提前做好准备。
(2)酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出。
(3)加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，关系到实验的成败，一定要按照教材的提示进行操作。加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。
(4)海藻酸钠的浓度关系到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。
(5)溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高而导致酵母菌死亡。
(6)可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照。
(7)刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡30 min左右，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法：一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。
2．实验结果分析与评价
(1)如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再做尝试。
(2)利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味，而不含酵母菌的凝胶珠所做的对照实验则无此现象。

考向一　固定化酶和固定化细胞
[例1] 下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是(　　)
A．固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显
B．在固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧
C．利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供适宜的营养条件
D．利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物
[解析]　固定化酶不像普通酶那样对环境要求那么高，耐受性也比较好，和溶解氧没什么关系；利用固定化酶降解水体中有机磷农药，不需要提供营养条件；利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类不仅是反应底物，同时也作为碳源来提供能量和营养。
[答案]　A
归纳拓展
(1)固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂，不会比一般酶制剂的生物活性更强。
(2)固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，可以像游离的细胞一样用于发酵生产。
       

考向二　制备固定化酵母细胞
[例2] 根据下面制备固定化酵母细胞实验的流程回答问题：
酵母细胞活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞
(1)在________状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物恢复________状态。活化前应选择足够大的容器，因为酵母细胞活化时________________。
(2)影响实验成败的关键步骤是________________________________________。
(3)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞数目________。
(4)观察形成的凝胶珠的颜色和形状：如果颜色过浅，说明______________；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，说明________________________________________。
(5)制备固定化酶不宜用包埋法，为什么？_________________________________
________________________________________________________________________。
[解析]　(1)酵母菌在干燥时，处于休眠状态，需加水活化，否则制成的固定化酵母菌在发酵时酶活性较低且酵母菌增殖缓慢。(2)该实验的关键是海藻酸钠溶液的配制。(3)如果海藻酸钠的浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞的数目减少，影响实验效果。(4)如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母菌数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再做尝试。(5)由于酵母菌细胞个体较大，不易从包埋材料中漏出，故细胞的固定化一般采用包埋法。
[答案]　(1)缺水　正常的生活　体积增大　(2)配制海藻酸钠溶液　(3)减少　(4)固定的酵母细胞数目较少　海藻酸钠浓度偏高，制作失败　(5)因为酶分子很小，容易从包埋材料中漏出
易错提醒
(1)选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种要单一。
(2)溶解CaCl2时勿用自来水，以免杂质离子影响实验结果。
(3)固定化酵母细胞时，应将海藻酸钠与酵母细胞的混合液用注射器缓慢滴加到CaCl2溶液中，而不是注射，以免影响凝胶珠的形成。

创新演练
1．下列关于固定化酶技术的说法，正确的是(　　)
A．固定化酶技术就是固定反应物，使酶依附着载体围绕反应物旋转的技术
B．固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应
C．固定化酶中的酶无法重复利用
D．固定化酶是将酶固定在一定空间的技术
解析：选D　固定化酶是利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术，其优点是酶被固定在一定装置内可重复利用，不足是无法催化一系列酶促反应。
2．分析下图，与用海藻酸钠作载体制备固定化酵母细胞相似的是(　　)

解析：选D　A是吸附法，B是化学结合法，C、D是包埋法，C一般是将酶包埋在细微网格里，D是将酶包埋在凝胶中。制备固定化酵母细胞采用包埋法，即将酵母菌包埋在海藻酸钠制成的凝胶中，与D相似。
3．下列说法错误的是(　　)
A．固定化酶和固定化细胞的技术方法包括包埋法、化学结合法和物理吸附法
B．固定化酶更适合采用化学结合法和物理吸附法
C．由于细胞个大，而酶分子很小，因此细胞多采用物理吸附法固定
D．反应物是大分子物质时应采用固定化酶
解析：选C　由于细胞个大，酶分子很小，个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。因此，细胞多采用包埋法固定，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定。
4．下列有关固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是 (　　)
A．可用包埋法制备固定化酵母细胞
B．反应产物对固定化酶的活性没有影响
C．葡萄糖异构酶在固定前后专一性不同
D．固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应
解析：选A　细胞难以被吸附或结合，固定化细胞多采用包埋法；反应产物积累能影响酶的结构，从而使酶的活性下降；葡萄糖异构酶在固定前后专一性不变；固定化细胞固定的是一系列的酶，可以催化一系列的反应，但不能催化各种反应底物的一系列反应。
5．某实验小组的同学制备固定化酵母细胞的过程如下：
①活化酵母细胞：称取定量干酵母与定量蒸馏水混合并搅拌，使酵母细胞活化。
②配制CaCl2溶液：将无水CaCl2溶解在定量蒸馏水中，配制成一定浓度的CaCl2溶液。
③配制海藻酸钠溶液：用定量的海藻酸钠直接溶解在定量的蒸馏水中，配制成溶液。
④海藻酸钠溶液和酵母细胞混合：将活化的酵母细胞迅速加入刚配制成的海藻酸钠溶液中，充分搅拌混合均匀。
⑤固定化酵母细胞：用注射器以恒定的速度缓慢将海藻酸钠和酵母细胞混合液滴加到配制好的CaCl2溶液中，观察凝胶珠的形成。
(1)请你改正其中两处错误的操作：
第一处：_________________________________________________________________
________________________。
第二处：________________________________________________________________
______________________。
(2)刚形成的凝胶珠要在CaCl2溶液中浸泡30 min左右，目的是__________________。
(3)如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，则说明海藻酸钠浓度________(填“过低”或“过高”)。
(4)研究发现，固定化强度强的酵母颗粒发酵效果好，且稳定性高、使用寿命长。某机构利用上述装置，将2%、2.5%、3%的海藻酸钠分别用2%、3%、4%的X溶液进行凝胶化处理，所得到的固定化酵母颗粒的强度及在28 ℃下发酵48 h后的酒精产量见下表：

海藻酸钠(%)        2        2.5        3        2        2.5        3        2        2.5        3
X溶液(%)        2        2        2        3        3        3        4        4        4
固定化强度(g/30个)        930        950        990        1 030        1 100        1 140        1 170        1 170        1 160
酒精量(%)        6.7        6.5        6.5        6.7        6.4        6.2        6.7        6.4        6.3
可以看出，随着X溶液浓度的增加，__________增加；凝胶固定化效果较好的海藻酸钠与X溶液的浓度分别是__________、__________。
解析：溶解海藻酸钠时需注意用小火间断加热，然后将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温后，再加入酵母菌充分搅拌混合均匀，以防止高温杀死酵母菌。分析表格可知，随着X溶液浓度的增加，酵母细胞的固定化强度增加，固定化强度和产酒精量都较大的海藻酸钠与X溶液浓度分别是2%、4%。
答案：(1)③海藻酸钠溶解应小火或间断加热至完全溶化　④海藻酸钠溶液应冷却至室温再加入已活化的酵母细胞　(2)让凝胶珠形成稳定的结构　(3)过低　(4)固定化强度　2%　4%


(满分50分　时间25分钟)
一、选择题(每小题3分，共24分)
1．下图中所示的固定化酶技术中属于包埋法的一组是(　　)

A．①②　　　　　　　                        B．①③④
C．①④                                                        D．③④
解析：选D　包埋法即将酶包埋于网格或胶囊中(如图中③④所示)，图中①为吸附法，②为化学结合法。
2．下列关于固定化酶的说法正确的是(　　)
A．酶被固定在不溶于水的载体上，可反复利用
B．酶作为催化剂，反应前后结构不改变，所以固定化酶可永远利用下去
C．酶由于被固定在载体上，所以丧失了高效性和专一性
D．被固定化的酶其活性部位完整，所以不受高温、强碱、强酸等条件影响
解析：选A　固定化酶可以被反复利用，但并非能永远利用下去；固定化酶是将酶分子结合在特定支持物上且不影响酶的功能，不会使酶丧失高效性和专一性；固定化酶的活性仍受温度、pH等环境条件的影响。
3．酶的固定化是将酶束缚或限制于一定区域内，使其进行酶促反应后可回收及重复利用的一类技术。下列关于固定化酶技术的叙述，错误的是(　　)
A．为使葡萄糖液与葡萄糖异构酶充分接触生产果糖，葡萄糖液应从固定化酶反应柱下端注入
B．制备固定化酶的方法主要有化学结合法和物理吸附法
C．固定化酶固定时可能会对酶造成损伤而影响其活性
D．用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆可以大幅度提高产量
解析：选A　葡萄糖液应从固定化酶反应柱的上端注入，使葡萄糖液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖。制备固定化酶的方法主要有化学结合法和物理吸附法。固定化酶固定时可能会对酶造成损伤而影响其活性。
4．下列关于固定化酶和一般酶制剂应用效果的说法中，错误的是(　　)
A．固定化酶生物活性强，可长久使用
B．一般酶制剂应用后和产物混在一起，产物的纯度不高
C．一般酶制剂参加反应后不能重复利用
D．固定化酶可以反复利用，以降低生产成本，并能提高产品的产量和质量
解析：选A　固定化酶是因为可回收重新利用而可以较长时间使用的，并不是因为生物活性强而长久使用。单纯从生物活性方面分析，固定化酶与一般酶制剂的活性差别不大。
5．下列关于使用固定化酶技术生产高果糖浆的说法正确的是(　　)
A．高果糖浆的生产需要使用果糖异构酶
B．在反应柱内的顶端装上分布着许多小孔的筛板，防止异物进入
C．将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，果糖从反应柱下端流出
D．固定化酶技术复杂，成本较高
解析：选C　生产高果糖浆时所用的酶应为葡萄糖异构酶，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由通过。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。
6.右图为某同学利用海藻酸钠固定化酵母细胞的实验结果，出现此结果的原因不可能是(　　)
A．海藻酸钠溶液浓度过高
B．酵母细胞已经死亡
C．注射器推进速度过快
D．注射器距离CaCl2溶液液面太近
解析：选B　题图中把海藻酸钠与酵母细胞混合后注射到CaCl2中形成的凝胶珠大小不均匀，可能是由A、C、D选项中的原因造成的，但酵母细胞死亡不会导致此结果。
7．用固定化酵母细胞发酵葡萄糖溶液时，为了能产生酒精，下列措施错误的是(　　)
A．向瓶内泵入氧气
B．应将装置放于适宜的条件下进行
C．瓶内应富含葡萄糖等底物
D．将瓶口密封，效果更好
解析：选A　在无氧条件下酵母细胞才能发酵产生酒精和CO2，保证无氧条件的措施是将瓶口密封。酵母细胞无氧发酵产生酒精时需要适宜的条件，如温度、pH以及底物葡萄糖等。
8．下图1表示制备固定化酵母细胞的有关操作，图2是利用固定化酵母细胞进行酒精发酵的示意图，下列叙述错误的是(　　)

A．刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液
B．图1中X溶液为CaCl2溶液，其作用是使海藻酸钠形成凝胶珠
C．图2发酵过程中搅拌的目的是使培养液与酵母菌充分接触
D．图1中制备的凝胶珠用蒸馏水洗涤后再转移到图2装置中
解析：选A　在该实验中，将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，再加入已活化的酵母细胞，否则高温会导致酵母细胞死亡；实验中氯化钙溶液的作用是使海藻酸钠形成凝胶珠；固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2～3次，再将其转移至10%的葡萄糖溶液中，并用搅拌器搅拌，目的是使培养液与固定化酵母细胞充分接触，有利于发酵的正常进行。
二、非选择题(共26分)
9．(14分)某一实验小组的同学，欲通过制备固定化酵母细胞进行葡萄糖溶液发酵实验，实验材料及用具齐全。请回答下列问题：
(1)制备固定化酵母细胞的过程为：
①使干酵母与________混合并搅拌，使酵母菌活化；
②将无水CaCl2溶解在蒸馏水中，配成CaCl2溶液；
③用酒精灯加热配制海藻酸钠溶液；
④海藻酸钠溶液冷却至常温再加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀；
⑤用注射器将______________的混合物缓慢滴入CaCl2溶液中。
(2)该实验小组用右图所示的装置来进行葡萄糖发酵。a是固定化酵母，b是反应柱。
①从上端漏斗中加入反应液的浓度不能过高的原因是____________________________________。
②要想得到较多的酒精，加入反应液后的操作是________活塞1和________活塞2。(填“关闭”或“打开”)
③为使该实验中所用到的固定化酵母细胞可以反复利用，实验过程一定要在____________条件下进行。
④装置中的长导管起的作用是________________________________________________________________________
________________。
解析：活化即使干酵母恢复生活状态。可通过加入蒸馏水，使其活化。若溶液浓度过高，酵母细胞会发生渗透失水。酵母细胞固定化操作应在无菌条件下进行。
答案：(1)①蒸馏水　⑤海藻酸钠和酵母细胞
(2)①葡萄糖溶液的浓度过高会使酵母细胞因失水过多而死亡　②关闭　关闭　③无菌　④释放CO2，防止空气中的杂菌进入反应柱

10．(12分)固定化酶是从20世纪60年代迅速发展起来的一种技术。东北农业大学科研人员利用双重固定法，即采用戊二醛作交联剂(使酶相互连接)，海藻酸钠作为包埋剂来固定小麦酯酶，研究固定化酶的性质，并对其最佳固定条件进行了探究。下图显示的是部分研究结果(注：酶活力为固定化酶催化化学反应的总效率，包括酶活性和酶的数量)，分析回答下列问题：

(1)从对温度变化适应性和应用范围的角度分析，由甲图所示结果可以得出的结论是______________________________________________。
(2)乙图曲线表明浓度为____________的海藻酸钠包埋效果最好，当海藻酸钠浓度较低时，酶活力较低的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)固定化酶的活力随使用次数的增多而下降，由丙图可知，固定化酯酶一般可重复使用________次，之后酶活力明显下降。
(4)固定小麦酯酶不仅采用海藻酸钠直接包埋，而且用戊二醛作交联剂，这是因为________________________________________________。
解析：(1)从对温度变化适应性和应用范围的角度分析，甲图反映了固定化酯酶比游离酯酶对温度变化适应性更强且应用范围较广。(2)乙图曲线表明浓度为3%的海藻酸钠包埋效果最好，当海藻酸钠浓度较低时，酶活力较低的原因是海藻酸钠浓度较低时包埋不紧密，酶分子容易漏出，数量不足。(3)由丙图可知，固定化酯酶一般可重复使用3次，之后酶活力明显下降。(4)固定小麦酯酶不仅采用海藻酸钠直接包埋，而且用戊二醛作交联剂，这是因为酶分子很小，很容易从包埋材料中漏出。
答案：(1)固定化酯酶比游离酯酶对温度变化适应性更强且应用范围较广　(2)3%　海藻酸钠浓度较低时包埋不紧密，酶分子容易漏出，数量不足　(3)3　(4)酶分子很小，很容易从包埋材料中漏出