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【听写】血红蛋白的提取和分离 1. 蛋白质分离和提取的原理是什么？
2. 什么是凝胶色谱法？
3. 凝胶色谱法的原理是什么？
4. 缓冲溶液的作用是什么？
5. 缓冲溶液通常如何配制？
6. 缓冲溶液的正确配制在生物化学实验中有什么意义？
7. 什么是电泳？
8. 电泳的原理是什么？
9. 在凝胶中加入 SDS 对蛋白质分子的电泳有何作用？
10. 分离血红蛋白应选取什么材料？为什么？
11. 写出血红蛋白的结构组成。
12. 采集血样后，如何分离红细胞？
13. 洗涤红细胞的目的和方法是什么？
14.血红蛋白释放的方法是什么？
15. 如何从混合液中分离血红蛋白溶液？
16. 透析袋具有怎样的特点？
17. 透析的目的是什么？
18. 凝胶色谱法的目的是什么？
19. 如何加速凝胶颗粒的膨胀？
20. 装填凝胶色谱柱时，有哪些注意事项？
21. 如何判断色谱柱装填是否成功？
22. 凝胶色谱柱加样时，需要注意什么？
23. 用凝胶色谱法分离血红蛋白时，何时收集流出液？
24. 用凝胶色谱法分离血红蛋白时，红色区带应该如何移动？
25. 常用的鉴定蛋白质纯度的方法是什么？
26. 在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？
27. 与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对进行血红蛋白的分离有什么意义？
【听写】血红蛋白的提取和分离 参考答案 1. 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
2. 凝胶色谱法是利用具有网状结构的凝胶，分离不同相对分子质量大小的蛋白质的方法。
3. 当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
4. 缓冲溶液具有缓冲作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液 pH 值的影响，维持 pH 基本不变。
5. 缓冲溶液通常由 1~2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同 pH 范围内使用的缓冲液。
6. 生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的 pH 下进行的，通过正确配制的缓冲溶液，能够在实验室条件下保证体外溶液的 pH 与体内环境中的 pH 基本一致，准确模拟生物体内的过程。
7. 电泳是带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
8. 电泳的原理：
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的 pH 下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
9. SDS作用机理: SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。SDS能使蛋白质发生完全变性，由几条肽链组成的蛋白质复合体在 SDS 的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。
10. 哺乳动物的红细胞无细胞核，其组成中除水分外，约90%是血红蛋白，因此便于作为提取血红蛋白的材料。
11. 血红蛋白由四条肽链组成，包括两条 α-肽链和两条 β-肽链，其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。
12. 分离红细胞：对血样进行低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果），如 500r/min 离心 2min ，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，得到下层暗红色的红细胞液体。
13. 洗涤红细胞的目的：去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。
洗涤方法：加入五倍体积的生理盐水（质量分数为 0.9％ 的氯化钠溶液），缓慢搅拌 10min ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中不再呈现黄色，表明洗涤干净。
14. 血红蛋白的释放：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液体积，再加 40％ 体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌 10 分钟（加速细胞破裂），细胞破裂释放出血红蛋白。
15. 分离血红蛋白溶液：
①过程：将搅拌好的混合液转移到离心管中，以 2000r/min 的速度离心 10min 。
②试管中溶液分为 4 层：
第1层（最上层）：有机溶剂甲苯层（无色透明）；
第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层）；
第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明)；
第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。
③分离：先用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
16. 透析袋一般是用玻璃纸（半透膜）制成，能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
17. 透析目的：除去样品中分子量较小的杂质（血红蛋白的粗分离）。
18. 凝胶色谱法目的：将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，实现血红蛋白的纯化。
19. 可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需 1~2h 。
优点：不但节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。
20. ①将色谱柱垂直装置固定在支架上。
②将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。
③凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。
④装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
⑤装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在约 50cm 高的操作压下，用 300mL 的 20mmol/L 的磷酸缓冲液（ pH 为 7.0 ）充分洗涤平衡 12 小时，使凝胶装填紧密。
21. ①由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。
②可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。
③如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
22. 滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要触及并破坏凝胶面。
23. 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 5mL收集一试管，连续收集。
24. 血红蛋白的红色区带应该狭窄、平整，随着洗脱液缓慢、均匀一致地移动。
25. 常用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质纯度的鉴定。
26. 让血红蛋白处在稳定的 pH 范围内，维持结构和功能正常。
27. 血红蛋白是有色蛋白（含有血红素），因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
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发表于 2020-4-17 06:01